无需厌氧培养条件即可检测环境中艰难梭菌分离株的选择性培养基

受污染的环境表面是艰难梭菌传播的一个重要来源。许多研究表明，医疗机构的环境消毒效果往往不尽如人意。对检测孢子污染有效且简单易操作的方法，将有助于通过识别环境污染，并提供一种监测消毒效果的手段，从而为改善环境消毒做出相应干预措施。商用 PCR 检测方法易于使用且广泛可用，但其灵敏度可能不足以检测低水平的环境污染。传统培养基的检测方法对检测艰难梭菌很敏感，但由于对厌氧培养条件和微生物学专业知识的要求较高，其实用性大打折扣。选择性厌氧肉汤培养预扩增毒素基因实时PCR检测为检测无症状艰难梭菌污染物提供了一种敏感的方法，这种方法可用于环境污染的检测，但其局限性包括需要厌氧培养条件和PCR检测的费用。

本研究的目标是开发一种廉价且易于使用的有效的检测方法。因此推荐这篇文章给大家，希望能对大家有所帮助。

Sensitive and Selective Culture Medium for Detection of Environmental Clostridium difficile Isolates without Requirement for Anaerobic Culture Conditions

内容

摘要：有效且易于使用的检测艰难梭菌孢子污染的方法将有助于确定环境蓄水池和监测室内消毒的效果。基于培养基的检测方法对检测艰难梭菌很敏感，但由于需要厌氧培养条件和微生物检验，其实用性受到限制。作者改良了一种含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的低成本选择性肉汤培养基，称为含硫代乙醇酸和L-胱氨酸的艰难梭菌布鲁氏菌肉汤（CDBB-TC），用于检测需氧培养条件下环境标本中的艰难梭菌。比较了 CDBB-TC（需氧培养条件下）和 CDBB（厌氧培养条件下）从病房表面采集的拭子中回收艰难梭菌的灵敏度和特异性。CDBB-TC 在回收环境艰难梭菌方面的灵敏度明显高于 CDBB（分别为 36/41 [88%] vs 21/41 [51%]；P = 0.006）。艰难梭菌乳胶凝集试验、毒素A和毒素B或谷氨酸脱氢酶酶联免疫测定以及毒素B基因PCR检测都是有效的确证试验。在总共 477 份环境培养物中，根据培养基呈黄色（阳性反应），但实际未发现艰难梭菌，CDBB-TC与CDBB的特异性分别为 100%（0个假阳性结果）和 96%（18个假阳性结果）。CDBB的假阳性培养是由于在CDBB-TC 中不生长的厌氧非艰难梭菌的生长造成的。我们的结果表明，CDBB-TC 为从环境样本中回收艰难梭菌提供了一种灵敏且具有选择性的培养基，且无需厌氧培养条件。

结果与讨论

艰难梭菌在CDBB与CDBB-TC中的萌发和生长的区别：

    如图1所示，CDBB-TC和CDBB的艰难梭菌孢子萌发和生长的速率和程度相似（图1）。根据对酒精的敏感性，大约90%的孢子（1 log）在30 min内萌发。

CDBB-TC和CDBB在实验室的灵敏度和选择性：

    从接种拭子中回收艰难梭菌孢CDBB-TC与CDBB相当（图2）。CDBB-TC和CDBB在接种2 log10 CFU孢子的拭子中一致获得阳性结果。从接种1 log₁₀ CFU孢子的拭子中获得阳性结果；9次试验中有3次（33%）CDBB阳性，9次试验中有7次（78%）CDBB-TC阳性。CDBB阳性培养在整个培养基管中呈黄色，而CDBB-TC阳性培养在培养管底部呈

CDBB-TC与CDBB对从病房表面收集的拭子中回收艰难梭菌的敏感性和特异性：

总共从477个表面收集了环境拭子（345个来自CDI病房的表面，132个来自便携式设备）。如图3所示，41份样品（9%）的CDBB-TC和CDBB培养物均呈阳性：其中16例两种培养基均为阳性，20例仅CDBB-TC为阳性，其中5例仅从CDBB中呈阳性。对于一种培养基呈阴性而另一种培养基呈阳性的环境样本，用艰难梭菌乳胶凝集试验对阴性样品进行验证试验，谷氨酸脱氢酶和毒素A和B的EIA，毒素B基因的PCR均为阴性。如果以所有艰难梭菌阳性培养作为标准，CDBB-TC的敏感性明显高于CDBB（36/41[88%]vs21/41[51%]；P=0.006），对于接受其他验证性试验的18份CDBB-TC培养阳性标本，CDBB-TC管底部的18个（100%）等分经其他确认试验检测为阳性，包括艰难梭菌乳胶凝集，毒素B基因的PCR，以及谷氨酸脱氢酶和毒素A、B的EIA。对于8个培养阴性的CDBB试管和8个培养阴性的CDBB-TC试管，通过相同的验证试验，试管底部的肉汤均为阴性。

在477个环境培养中，基于没有艰难梭菌的假阳性黄色培养基的CDBB-TC和CDBB的特异性分别为100%（0个假阳性结果）和96%（18个假阳性结果）（P=0.0001）。18个CDBB假阳性培养可归因于非艰难梭菌厌氧生物的生长，而它们没有在CDBB-TC的有氧环境中生长。

研究了不同pH值下硫代乙醇酸对艰难梭菌孢子萌发的影响：

    如图4所示，艰难梭菌孢子在无菌水中或1 mg/ml硫乙醇酸且pH 5时最小萌发（基于1 mg/ml溶菌酶的孢子减少）（P≥0.82）；但是，在pH7.6，在80°C时，1 mg/ml硫乙醇酸（P＜0.0001）中孢子显著减少，溶菌酶没有进一步增强（P=0.74）。

讨论：综合研究报道及实验结果表明：pH值为7.6而非pH值为5时，硫代乙醇酸可以刺激环境孢子恢复，溶菌酶提高艰难梭菌从环境样品中的回收率。硫代乙醇酸可能使孢子对溶菌酶活性敏感，可能是通过破坏二硫键和增加溶菌酶对作用位点的渗透。

含有硫代乙醇酸和L-胱氨酸的肉汤培养基为环境标本提供了一种敏感和更具选择性的培养方法，而不需要厌氧培养条件。这种培养基很容易制备，且价格相对便宜。此外，对微生物学专业知识的要求，因为基于颜色变化的阳性肉汤样品可以被确认为艰难梭菌。

多数厌氧生物在CDBB上生长，并导致颜色变为黄色。这些生物在有氧条件下培养的CDBB-TC中不生长，但在厌氧条件下培养的CDBB-TC上生长，这表明CDBB-TC比CDBB更具有选择性。

本研究还具有一定的局限性。培养基是定性的，不能对污染负荷进行评估。与海绵相比，拭子回收孢子的灵敏度可能会降低，并且环境样本仅从一家机构采集，还需在多个机构额外进行更大规模的研究。最后只测试了一种商用实时 PCR 检测方法，不同核扩增检测方法的灵敏度可能存在差异。