一种提高海洋弧菌分离的改良培养基

由于海洋弧菌难以分离，生态学和生物技术研究都对它们产生了极大的兴趣。在检测食源性致病性物种方面已经作出了许多研究，但关于标准培养基对环境弧菌的性能，我们知之甚少。

为此推荐本篇文章与大家一起学习，希望能对大家有所帮助。

文提出了一种改良的TCBS作为分离培养基，根据海洋弧菌需求进行调整，与标准培养基相比，大大提高了海洋弧菌在稀释后于平板上的回收率。

内容

1.摘要

TCBS琼脂是最早用于分离和纯化弧菌的选择性培养基之一，并且仍然被广泛使用。TCBS已被广泛用于分离来自临床标本和食物，以及水生环境中的致病弧菌（霍乱弧菌，副溶血性弧菌，创伤弧菌）。此外，它还被作为所有弧菌（霍利斯弧菌和麦氏弧菌除外）的分离和计数培养基。

这种培养基可以根据蔗糖的发酵能力来区分不同的弧菌种类，如霍乱弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌产生黄色菌落;相反，不发酵蔗糖的，如创伤弧菌和副溶血弧菌，产生绿色菌落。 尽管对弧菌具有选择性，但其他属如葡萄球菌属、黄杆菌属、假交替单胞菌属和瓦氏菌也可以在TCBS上生长，但由于其独特的表型，它们的菌落可以与弧菌区分开来。

对于海洋弧菌，TCBS培养基实际上不能被认为完全适合海洋弧菌的分离。为此提出了一种改良的TCBS，以确保海洋弧菌在琼脂平板上的最大回收率。改良的TCBS可以恢复其他未检测到的弧菌，其中一些可以产生有生物技术价值的酶，从而扩大潜在的新弧菌类群的分离能力。此外，报道了一种新设计的弧菌特异性PCR引物对，靶向独特的rpoD序列，有助于快速确认分离菌作为弧菌成员和随后的遗传分析。

2.结果与讨论

改良培养基的测试

将TCBS（标准培养基）的弧菌菌落产量与各种改良培养基（即mTCBS，mTCBS-2，mTCBS-aSW，TCBS-S和TCBS + MB）进行了比较，与TCBS相比，它们都具有更高的离子强度。

除TCBS-S以外，与标准培养基相比，观察到弧菌菌落数量平均增加两倍（图1和图2）。用NaCl补充TCBS并没有导致所有其他配方计数增加，因此表明其他配方的回收率主要来自于总体盐含量，而不是离子强度本身。

略微降低盐含量，用mTCBS或mTCBS-aSW替换TCBS-2被证明是有益的，因为它改善了菌落大小，而没有降低改良培养基相对于标准TCBS的优势，可能是因为整体盐浓度更平衡。TCBS + MB生长最茂盛，导致非常大的菌落，可能是因为营养浓度要高得多，再加上平衡的盐混合物（数据未显示）。

FIGURE 1 Improved plate count on mTCBS. Comparison of Vibrio spp. plate counts of a dilution from a fish buccal swab. (a) Colonies on TCBS(standard medium). (b) Colonies onto mTCBS (modified medium)

FIGURE 2 Comparison of Vibrio recovery with different media. Vibrio spp. colony yield from three randomly selected fish buccal swabs plated on TCBS and mTCBS

改良培养基可提高细胞适应性和存活率

通过比较标准培养基和改良培养基获得的结果促使我们研究哪些弧菌可能无法在标准培养基上生长。为此选择了显示最相关计数差异的琼脂平板进行进一步的调查。特别是，在mTCBS上挑取90个单菌落同时接种在TCBS和 mTCBS 上，以确定导致这种平板计数差异的细菌。出乎意料的是，90株分离株中87株在TCBS和mTCBS上生长，然而其中只有大约50%（对应于CFU_TCBS/CFU_mTCBS）被预计会生长。据此推测，在TCBS上分析天然样品时，菌落回收率较低，这可能反映了某些分离株的大多数细胞对选择性培养基的适应性较差，而不是完全无法生长。

为了研究这种可能性，将 87 个分离株在海生菌肉汤（作为非选择性培养基）中培养，适当稀释，并接种到海生菌琼脂（MA，作为阳性对照）、TCBS 和 mTCBS 平板上。

在 MA 和 mTCBS 上，观察到相当的生长，所有位点都显示汇合生长，而在 TCBS 上，90株检测分离株中的57株只产生了一些大小不同的菌落（大多数非常小），而在较高稀释度下未生长落，从而支持我们的假设。

为了排除这种结果可能是由于遗传异质性，从TCBS上获得的小菌落和大菌落都被分离出来，在MB中生长（以排除任何选择），并再次测试。菌落大小被证明不是固有特征，因为无论起始菌落的大小如何，在 mTCBS 和 MA 上都获得了正常和均匀大小的菌落;然而，在TCBS上再次观察到低回收率和菌落大小异质性。这些结果支持了细胞对 TCBS 适应率低的假设，表明在TCBS上观察到的菌落大小减少可能与少数单细胞对培养基的晚期增加相对应，导致增长延迟。综合考虑这些观察结果，可以解释mTCBS与TCBS的回收能力不同。

弧菌鉴定

所有在TCBS上生长的弧菌分离株根据核糖体基因间隔模式进行分组，并通过16S rDNA PCR扩增和测序选择每个分离株（共4个，即VD、VL、VN、VO）进行分子鉴定。

BLAST分析将VD和VN序列分配给得分相同的巨型弧菌和牡蛎弧菌;VN 和 VO 被分配到卡那罗弧菌。

分离株的蛋白水解活性

为了检测和表征环境分离物的蛋白水解活性，包括分子大小分布，通过电泳法对鉴定的细菌进行电泳分离后的明胶酶活性筛选。所有分离株，包括4个特征分离株，均表现出不同的分泌蛋白水解酶模式，分子量富集于40 KDa以下（图3）。这些结果表明，它们具有作为低分子量分泌蛋白酶来源的应用潜力，进一步的功能分析表明，即使在恶劣的条件和低温下，丝氨酸蛋白酶和金属蛋白酶也具有很高的活性（数据未显示）。低分子量酶，以及那些在极端条件下表现出高稳定性和活性的酶，因其潜在的生物技术应用而特别有吸引力。

FIGURE 3 Secreted proteases activity of isolates. Aliquots of culture medium after overnight growth ofrepresentative isolates were analyzed to detect gelatinolytic activity of secreted proteases. On the left, positions of molecular weight marker bands are reported. Lane 1–12: Vibrio isolates from mTCBS

讨论

本文报道的数据清楚地表明，一些海洋弧菌无法在选择性培养基（如标准TCBS琼脂）上生长，并且它们需要调整培养基组成才能成功分离。事实上，使用改良的TCBS培养基大大提高了这些微生物的整体回收率，在大量的平板上数量增加，应考虑使用调整后的培养基，以更好地满足细菌的生理要求。

改良培养基使我们能够分离出原本未被发现的弧菌，这些弧菌被证明可以产生具有生物技术吸引力的低分子量酶，这突出了如何提高分离能力，极大地有助于扩大从自然环境中提取合适酶的产量。为此我们强烈建议在海洋弧菌的任何分离或计数时使用改良的TCBS。